Análisis de la calidad de ADN complementario ADNc como base molecular para estudios de expresión génica en Dunaliella spp.

Abstract

La extracción de ARN y síntesis de ADNc son la base de la mayoría de análisis moleculares que implican expresión génica. Tanto la cantidad como la calidad del ARN garantizan una mayor precisión en los análisis posteriores, así mismo, la reacción de transcripción inversa es considerada un enfoque más rentable por su alta sensibilidad, sin embargo, el aislamiento de ARN intacto es un desafío por su susceptibilidad a la hidrólisis y degradación enzimática por medio de ribonucleasas. El presente estudio, tiene como objetivo principal analizar la calidad de ADN complementario (ADNc) obtenido desde el ARN total a través de la enzima transcriptasa inversa para estudios de expresión génica en Dunaliella spp., se realizó en el laboratorio de molecular del Centro de Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad Estatal Península de Santa Elena, donde se compararon tres protocolos de ARN en dos condiciones de muestra (Muestra directa del cultivo; Muestra congelada) y cuatro protocolos para la síntesis de ADNc a partir de variaciones en la transcriptasa inversa (RT) e inhibidor de RNasas. Los resultados demostraron que el protocolo III a partir de columna de sílice con proteinasa K (Thermo Scientific™ K0732) fue más eficiente tanto para muestras congeladas como directas obteniendo altas concentraciones (Congelada = 734.2 ng/ µL y Directa = 505.43 ng/ µL) y purezas óptimas en A260/280 de (Congelada ~ 2 y Directa ~2). Para la síntesis de ADNc el método estandarizado se basó en agregar 1 µL de RT y 1 µL de inhibidor de RNasas por cada 8 µL de ARN total (RT 1 con inhibidor), que presentó mayor rendimiento de ADNc (4.32 ng de ADNc/ ng de ARN), mientras que el protocolo con mejores índices de pureza de ADNc fue RT 1.5 sin inhibidor (~ 1.7 – 179). Se concluye que, en cualquier combinación entre método de ARN y protocolo de ADNc , las cantidades de ADNc sintetizadas son suficientes para estudios de expresión génica.